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    Quick Cell 外泌體提取試劑盒使用說明書

    發布時間:2017/11/16      點擊次數:6169

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    Quick Cell 外泌體提取試劑盒

    產品名稱

    貨號

    規格

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    價格()

    Quick Cell 外泌體提取試劑盒

    D3030L1411

    20 T

    常溫

    5500

     

    產品描述
       外泌體是由細胞分泌的包含RNA和蛋白質的小囊泡(20-200 nm),在血液、唾液、尿液及乳汁等體液中大量存在。外泌體被認為具有細胞間信使的功能,在特定細胞之間傳遞它們的效應物或信號分子;然而其構造、效應物組成以及所參與的生物學通路目前尚不明晰。
     外泌體的生物學功能研究中需要分離完整的外泌體顆粒,而傳統超速離心方法步驟繁瑣、硬件要求高、操作難度大。李記生物自主開發的外泌體快速提取試劑盒,組分經過優化處理,適用于細胞培養上清液、血清、血漿、尿液及其他體液(腦脊液、腹水、羊水、乳汁以及唾液等)中的外泌體提取,并搭配純化過濾裝置,可快速地獲得高純度外泌體顆粒。
    本試劑盒處理單位樣品成本僅為國外同類產品的1/6-1/3,經上海市計量測試技術研究院檢測,本試劑盒與國外產品提取純化相同樣品所得的外泌體,沒有顯著差異。
    試劑盒組成

    組分名稱

    貨號

    規格

    Exosomoe Concentration Solution

    D3030L1411-1

    100 mL

    Exosomoe Purification Filter

    D3030L1411-2

    20 tubes(2mL)

           *RNase/DNase Free, Sterile

    運輸與保存條件

    常溫運輸,室溫條件下質保期24個月,使用前充分混勻。

    使用方法

    1.條件準備 

    高速離心機(可達10000g離心力);2mL、50mL(15mL)離心轉子;1.5mL,50mL(15mL)離心管; 1×PBS緩沖液。

    2.樣品預處理

    樣品準備:如果是凍存樣品,從冰箱取出后于25℃水浴中進行解凍,將完全融化后的樣品置于冰上;如果是新鮮樣品,收集樣品后置于冰上;

    離心去除細胞碎片,將樣品轉移至離心管中,在4℃,3000 g條件下離心10 min,取上清轉移到新離心管中。

    離心去除其他雜質,*次離心收集的上清液,在4℃,10000 g條件下離心20 min,取離心上清液轉移到新的離心管中備用。

    注:本試劑盒盒可處理多種樣品,處理量因樣品種類不同而有差異。單次提取可處理的不同樣品量范圍見下表。

    表1.單次提取可以處理的不同樣品量的范圍(單位:mL)

    樣品名稱

    細胞上清

    血清

    血漿

    尿液

    腦脊液

    腹水

    羊水

    乳液

    唾液

    樣 品 量

    120

    0.510

    0.510

    120

    120

    120

    120

    120

    0.510

    3.提取外泌體

    上清液預處理:在去除雜質的離心上清液中加入Exosomoe Concentration Solution(ECS試劑);部分粘稠的樣品(血清、血漿、乳液、唾液等)需先加入預冷的與樣品等體積的1×PBS進行稀釋,之后再加入ECS試劑,試劑用量如下表,表中樣品為舉例值,其他劑量樣品根據表中的試劑用量等比例調整。

    表2.外泌體提取試劑用量表(單位:mL)

    樣品名稱

    細胞上清

    血清

    血漿

    尿液

    腦脊液

    腹水

    羊水

    乳液

    唾液

    樣品劑量

    20

    10

    10

    20

    20

    20

    20

    10

    10

    1 x PBS

    20

    10

    10

    /

    /

    /

    /

    10

    10

    ECS

    5

    5

    5

    5

    5

    5

    5

    5

    5

     

    溶液混合:加入ECS試劑后將離心管蓋緊,上下顛倒離心管10-20次,再放置于2℃至8℃靜置過夜(10 h-12 h);

    沉淀外泌體:取出裝有混合液的離心管于4℃以10000 g離心60 min,棄上清,沉淀中富含外泌體顆粒;(注:盡可能吸凈上清液)

    外泌體重懸:取400μL 1×PBS均勻吹打離心沉淀物,待其均勻懸浮在PBS中后,將重懸液轉移至新的1.5 mL離心管中;

    收獲外泌體顆粒:將含有重懸液的1.5mL離心管于4℃以12000 g離心2 min,保留上清液,該上清液中富含外泌體顆粒。

    4.純化外泌體

    純化外泌體:將收獲的外泌體顆粒粗品轉入Exosomoe Purification Filter(EPF柱)上室中,于4℃以3000 g離心10 min,離心后收集EPF柱管底的液體,此液體即為純化后的外泌體顆粒;

    外泌體的保存:純化后的外泌體以50 -100μL進行分裝,分裝后的外泌體保存于-80℃低溫冰箱中,以備后繼實驗使用。

    常見問題

    Q1:粘度大的待測樣本如何處理?

    A1:待測樣品粘度過大時,可將樣本用4預冷的1×PBS緩沖液進行等體積稀釋處理。

    Q2:收獲的外泌體顆粒無法通過EPF柱純化時怎么處理?

    A2:由血清、血漿、唾液等樣品收獲的外泌體濃度較高,此時可用4℃預冷的     1×PBS進行稀釋后再通過EPF柱離心。

    Q3: 外泌體如何保存?

    A3:純化完成后的外泌體可50 μL-100 μL分裝后保存于-80℃備用。

    Q4:如何鑒定提取的外泌體?

    A4:針對外泌體標志蛋白(CD63, CD9, CD81等)進行Western blot檢測鑒定所提的外泌體Q5:培養細胞時,血清來源的外泌體怎么去除?

    A5:多數情況下,細胞在體外培養需要血清,但血清中含有外泌體,為了避免血清污染細胞產生的外泌體,一般采用2種方法:

    細胞培養前,通過100000×g超速離心過夜,去除血清外泌體。

    可選擇無血清培養基進行培養。

    Q6:細胞培養過程中死細胞是否會影響外泌體的提???

    A6:會的。在收獲細胞時,應確定死亡細胞占所有細胞5%以下。細胞死亡過程中會釋放大量大小不等的囊泡,細胞zui終會裂成碎片,它們在外泌體的純化過程中會污染活細胞產生的外泌體。

    應用案例

    1、外泌體電鏡檢測:

        本試劑盒提取純化的PC-12細胞培養上清液中的外泌體顆粒,通過透射電鏡(TEM)檢測的結果:

     

    從電鏡照片中可觀察到100 nm左右、具有清晰的膜的茶托樣結構,符合外泌體的結構特性(scale bar=100 nm)。

     

    2、外泌體粒徑檢測:

        本試劑盒提取純化的PC-12細胞培養上清液中的外泌體顆粒,通過美國PPS公司(Particle Sizing Systems) Nicomp 380 Z3000粒度儀檢測的結果:

     

     

     

    從粒徑檢測結果來看,納米顆粒主要分布在10-100nM之間,和預期的外泌體顆粒大小基本吻合(橫坐標單位為 nM)。

     

    3、Western blot及qPCR檢測:

     

     

    上圖為本試劑盒提取的MCF-7及MHCC97H細胞培養上清液中外泌體膜蛋白CD63的western blot(A)和miRNA qPCR(B)檢測結果。

     

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