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    AB11L234-G418(遺傳霉素)

    簡要描述:AB11L234-G418(遺傳霉素),也稱作Geneticin (遺傳霉素)、G418、G 418或者G-418,是一種結構類似于慶大霉素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷類抗生素,來源于Micromonospora rhodorangea,常用于篩選表達neo基因的真核或原核多克隆或單克隆細胞。

    • 產品型號:
    • 廠商性質:生產廠家
    • 更新時間:2022-08-25
    • 訪  問  量:165

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    品牌自營品牌供貨周期現貨
    應用領域醫療衛生,生物產業,制藥

    AB11L234-G418(遺傳霉素),也稱作Geneticin (遺傳霉素)、G418、G 418或者G-418,是一種結構類似于慶大霉素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷類抗生素,來源于Micromonospora rhodorangea,常用于篩選表達neo基因的真核或原核多克隆或單克隆細胞。

    G418不僅用于穩定細胞株的篩選,也用于穩定細胞株的維持。本產品的50mg/ml包裝經過過濾除菌,可以直接用于細胞培養。

    在細菌、酵母、原生動物、蠕蟲、高等植物和哺乳動物中,遺傳霉素通過抑制蛋白合成而抑制或殺死細胞。其作用機制為遺傳霉素能夠與70S和80S核糖體結合,從而阻斷肽鏈延伸,干擾蛋白合成。其抗性基因(主要為neo基因)位于轉座子Tn601 (903)或Tn5(來源于細菌),可以在真核細胞中表達。通過基因重組技術將這些抗性基因導入細胞,使細胞表達抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase, APH(3)II),從而獲得對G418的耐藥性,用來篩選和維持培養攜帶抗性基因的原核或者真核細胞。

    哺乳動物細胞中,當抗性基因neo被整合進真核細胞基因組后 ,編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase, APH(3)II)。此酶通過共價修飾G418的氨基或羥基功能,抑制抗生素-核糖體間的相互作用,從而使得抗生素失活。這一特性賦予細胞產生抗性而能在含有G418的選擇性培養基中生長。進行穩轉細胞株篩選實驗時,需要建立劑量反應曲線(dose-response curve or kill curve)確定殺死無抗性細胞的zui低有效濃度。

    植物細胞中,通過轉染攜帶nptII基因的抗性質粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶,這個酶使得多種抗生素喪失活性,包括 G418,卡那霉素和巴龍霉素。

    G 418與新霉素同為氨基糖苷類抗生素,都可被Neo基因產物失活,因此都可以用于篩選攜帶Neo抗性基因的細胞,新霉素篩選的細胞都可以用G418替代。


    訂購信息


    產品名稱

    貨號

    規格

    價格

    G418(遺傳霉素)

    AB11L234

    1 g

    550




    運輸與保存



    常溫運輸。4℃保存,有效期36個月。


    技術參數


    1.CAS:108321-42-2

    2.分子式:C20H40N4O10·2H2SO4  

    4.分子量:692.71

    5.純度:~98%
    6.結構式:

    AB11L234-G418(遺傳霉素)使用方法


    1.G418儲存液的配制(50mg/ml,活性濃度)
    (1)活力單位的換算
      根據此公式進行換算:(1000/A0)×A1=A2,其中A0是G418的活力值(Potency),因批次而異,具體見瓶子的標簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實際稱重的粉末與體積比濃度。
      比如若所用批次的G418 活力值為:750µg/mg,要配制50mg/ml的G418活性濃度,則實際要配制的粉末濃度為1000/750×50mg/ml=66.33mg/ml。
      如果配制10ml的G418儲存液(活性濃度,50mg/ml),則需要稱取663.3mg粉末。
    (2)除菌和保存
      根據上述換算得到的實際粉末稱重量,加入10ml無菌去離子水使其完全溶解。
      先用5ml無菌去離子水預濕潤0.22μm針頭式過濾器,除盡水。之后使用此濾器過濾,除菌后分裝成單次使用的小量(如1ml)放到-20℃凍存,1年穩定。
    【注】:不要對混濁的溶液進行過濾,因為混濁的溶液意味著藥物未完全溶解,過濾過程中會造成藥物損失,降低活性;不建議使用液體培養基,NaCl,磷酸鹽溶液或者有機溶劑來制備儲存液;配制G418溶液時,一定要根據相應批次G418標注的活力值(potency)來進行換算,從而得到需要活性濃度的儲存液以及工作液。
    2.建議使用濃度
      一般來說,剛開始篩選轉化子需要高濃度的G418,并用一個較低濃度的G418維持培養。生長條件,細胞類型和其它的環境因素都可能影響G418的用量,因此第一次使用的實驗體系建議通過劑量反應性曲線(dose-response curve or kill curve),來確定最佳篩選濃度。
      通常情況,哺乳動物細胞篩選范圍200-2000μg/ml;植物細胞:10-100μg/ml;酵母細胞:500-1000μg/ml。

    表1.部分哺乳動物細胞的推薦工作濃度表。

    細胞名稱

    細胞類型

    濃度

    B16

    Mouse melanocytes

    400-1000μg/ml

    CHO

    Chinese hamster ovarian cells

    400-800μgμg/ml

    Hela

    Human uterine cells

    200-400μg/ml

    HEK293

    Human embryonic kidney cells

    200-500μg/ml

    THP-1

    Human monocytes

    250μg/ml

     

    3.遺傳霉素劑量反應曲線的建立
      遺傳霉素的有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態、細胞密度、細胞代謝及細胞所處細胞周期等因素相關。為了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株,確定能夠殺死未轉染宿主細胞的遺傳霉素zui低濃度非常重要,對于初次使用的細胞,一般需要通過實驗來確定適合自身實驗體系的劑量反應曲線(dose-response curve or kill curve),曲線建立時至少應設置6個遺傳霉素濃度。遺傳霉素處理分裂期的細胞時活性*,因此在添加遺傳霉素之前需要先將細胞培養一段時間。
    (1)第一天:未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上,37℃,CO2培養過夜。
    注:對于需要更高密度來檢測活力的細胞,可增加接種量。
    (2)根據細胞類型,設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例,可設定0、50、100、200、400、800、1000μg/ml。
    (3)第二天:去除舊的培養基,換用新鮮配制的含有相應濃度遺傳霉素的培養基。每個濃度做三個平行孔。更換培養基后在細胞培養箱中繼續培養。
    (4)接下來每3-4 d更換新的含藥物培養基。
    (5)按照固定的周期(如每2 d)進行活細胞計數來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數(通常是7-10 d)內能夠殺死絕大多數細胞的zui低濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。
    4.穩定轉染細胞株的篩選
    (1)細胞轉染48h后,將細胞置于含有適當濃度遺傳霉素的新鮮培養基中培養,此為處理組。
    (2)【注】:當細胞處于分裂活躍期時,抗生素作用zui明顯。當細胞過于密集,抗生素產生的效力會明顯下降,所以細胞的密度最好不超過25%。建議同時做一個正常細胞的對照組。轉染或感染48 h后,如果細胞過密也可以消化后重新接種細胞,培養過夜后即可進行遺傳霉素篩選。每隔3-4 d更換含有遺傳霉素的培養液。

    (3)篩選7 d后觀察并評估細胞克隆(集落)的形成情況。對照組正常細胞應該100%死亡,處理組中存活的細胞為表達neo基因的細胞。根據宿主細胞種類和轉染/篩選效率不同,集落的形成可能需要一周或者更多的時間。
    (4)克隆形成后,挑取并轉移5-10個抗性克隆于35mm細胞培養板,繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7 d。
    (5)之后更換正常培養基培養即可。


    注意事項


    1.本產品僅限于科學實驗研究使用,不得用于臨床診斷、治療等領域。

    2.用于細胞實驗,溶解后,須用一次性針頭濾器過濾除菌。

    3.本產品不可高壓滅菌。

    4.G418不要和其它抗生素/抗真菌劑(如青霉素/鏈霉素)共同使用,因為它們是G418的競爭性抑制劑。其它的抗生素也會產生交叉活性。

    5.G418加入培養體系中,未轉染的細胞有可能不會被殺死,原因在于藥物濃度過低,或者細胞密度過高。另外,快速分裂的細胞相對于緩慢增殖細胞,更容易被殺死。對照細胞(未轉染)可能在添加抗生素5-7 d后才能被殺死,轉染細胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14 d形成。

    6.即使加入有效劑量的G418,細胞可能會繼續分裂2-3次。G418的藥效通常在2 d后才變得明顯。

    7.本產品可能對人體有一定的毒害作用,請注意適當防護,以避免直接接觸人體或吸入體內。

    8.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

    9.抗生素不穩定,請在有效期內盡快使用。

    10.以上數據均來自公開文獻, 李記生物暫未本產品進行獨立驗證, 僅供參考。


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