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    Zeocin (博萊霉素)

    簡要描述:Zeocin (博萊霉素)Zeocin即phleomycin D1,中文名稱博來霉素或者腐草霉素D1,是從輪狀鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的一個突變體菌株中分離而來的博來霉素/腐草霉素(bleomycin/phleomycin)的抗生素家族成員。它對細菌、真菌(包括酵母)、植物和哺乳動物細胞均有抑制作用和細胞毒性。

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    • 廠商性質:生產廠家
    • 更新時間:2022-08-25
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    Zeocin (博萊霉素)Zeocin即phleomycin D1,中文名稱博來霉素或者腐草霉素D1,是從輪狀鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的一個突變體菌株中分離而來的博來霉素/腐草霉素(bleomycin/phleomycin)的抗生素家族成員。它對細菌、真菌(包括酵母)、植物和哺乳動物細胞均有抑制作用和細胞毒性。

    Zeocin是一種堿性、水溶性的、銅離子螯合的糖肽抗生素。Cu2+螯合的Zeocin溶液呈現藍色,無活性。當其進入細胞后,Zeocin上的Cu2+被還原為一價銅離子(Cu+),并被細胞內的巰基化合物(sulfhydryl compound)清除,導致Zeocin被活化,能夠結合到細胞內DNA上并使其斷裂,最終導致細胞死亡。

    對Zeocin產生抗性的蛋白是來源于印度鏈球菌(Streptoalloteichus hindustanus)的Sh ble基因編碼一種14kDa大小的蛋白,它能夠以一定比率結合Zeocin,使其不能結合細胞DNA,抑制其DNA斷裂活性,從而使細胞對Zeocin產生抗性。因此,Zeocin可用來篩選表達Zeocin抗性基因的多克隆或單克隆細胞,或用于相應的多克隆或單克隆細胞的維持性培養。

    Zeocin對于絕大多數好氧細胞均有效,常用于細菌(如大腸桿菌)、真核微生物(如酵母)及動植物細胞的篩選。大腸桿菌篩選推薦濃度為25~50μg/ml (低鹽LB培養基,NaCl濃度不能超過5g/L);酵母篩選推薦濃度為50~300ug/ml (YPD或基本培養基);哺乳動物細胞篩選推薦濃度為50~1000ug/ml (合適培養基,根據細胞系的類型而不同)。實際應用時,應針對不同的細胞系測試Zeocin的濃度梯度,以確定最佳使用濃度。


    訂購信息


    產品名稱

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    規格

    價格

    Zeocin (博萊霉素)

    AB11L251

    1.25mL

    940




    運輸與保存



    藍冰運輸。-20℃避光保存,有效期12個月?!咀ⅰ浚罕苊夥磸蛢鋈?。


    技術參數


    1.CAS:11006-33-0

    2.分子式:C55H85O21N20S2Cu

    3.分子量:1474.03

    4.溶解性:H2O: 50 mg/mL

    5.結構式:


    使用方法


    1.細菌的篩選(以大腸桿菌為例)
    (1)使用不含Tn5轉座子元件的宿主細胞DH5和DH10等進行篩選
    (2)需使用低鹽LB培養基(10g胰蛋白胨,5g NaCl,5g酵母提取物,調整pH至7.5,加水定容至1L)以維持Zeocin的活性。
    (3)Zeocin篩選的推薦濃度為25~50μg/ml。
    2.真菌的篩選(以酵母為例)
    (1)適用于釀酒酵母和畢赤酵母。
    (2)培養基的選擇:含1M山梨醇的YPD培養基(適用于電穿孔法轉染細胞);YPD或基本培養基(適用于化學法轉染細胞)。調整培養基pH至6.5~8.0,并選擇使用zui低有效濃度的Zeocin進行篩選。
    (3)轉染方法:需使用電穿孔或鋰離子轉染法。不要使用酵母原生質球(spheroplasting)進行Zeocin抗性的轉染及篩選,因為Zeocin會導致原生質球的完全死亡。
    (4)Zeocin篩選的推薦濃度為50~300μg/ml。具體濃度與酵母菌株、培養基pH以及離子強度有關。
    3.哺乳動物穩定表達細胞株的篩選
     Zeocin用于哺乳動物細胞篩選常用濃度為50-1000μg/ml (平均常用濃度為250-400μg/ml)。影響篩選濃度的主要因素包括離子強度、細胞類型、細胞生長密度以及生長速率。根據細胞類型的不同,需要1-2周可以篩選到Zeocin抗性的細胞。在篩選穩定表達細胞株之前,需要先確定能夠殺死未轉染細胞的Zeocin最佳工作濃度。Zeocin的最佳工作濃度需要通過劑量效應曲線來確定。下表中列出了部分細胞中Zeocin的篩選濃度范圍以供參考。

    表1.部分常見哺乳動物細胞的Zeocin推薦篩選濃度表

    Cell Type

    Culture Medium

    Zeocin Concentration

    B16 (Mouse melanocytes)

    RPMI

    20-250μg/ml

    CHO (Chinese hamster ovarian cells)

    DMEM

    100-500μg/ml

    COS (Monkey kidney cells)

    DMEM

    100-400μg/ml

    HEK293 (Human embryonic kidney cells)

    DMEM

    100-400μg/ml

    HeLa (Human uterine cells)

    DMEM

    50-100μg/ml

    J558L (Mouse melanocytes)

    RPMI

    400μg/ml

    MCF-7 (Human breast adenocarcinoma cells)

    DMEM

    100-400μg/ml

    MEFs (Mouse embryonic fibroblasts)

    DMEM

    200-400μg/ml

    THP-1 (Human monocytes)

    RMPI

    200μg/ml

     (1)細胞對Zeocin敏感性的確定(殺滅曲線的建立)

    ①接種細胞使得細胞密度約為25%,按照8、16或24個細胞培養孔(分別為單個培養孔、復孔和三復孔)準備培養的細胞,培養24h。
    ②去除細胞培養液,換成含不同濃度Zeocin的新鮮篩選培養液(0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000μg/ml)。
    ③每2-4天更換新鮮的篩選培養液,觀察存活細胞的比例,選擇在1-2周內殺死所有細胞的zui低濃度作為最佳工作濃度。
    (2)篩選Zeocin抗性的穩定細胞株
    ①按照20%-30%的細胞密度接種細胞,培養過夜。
    ②轉染攜帶Zeocin抗性基因的質?;蚋腥緮y帶Zeocin抗性基因的病毒,同時設置沒有轉染質?;蚋腥静《镜募毎鳛閷φ?。說明:沒有轉染質?;蚋腥静《镜募毎?,也需要同樣進行轉染質?;蚋腥静《镜南鄳獙嶒灢僮?。
    ③轉染或感染48-72 h后,換成含有最佳工作濃度的Zeocin (由步驟a中的殺滅曲線確定)的新鮮培養液,繼續培養。如果有必要,可以對細胞進行傳代,略稀釋后進行篩選培養。
    ④每2-4天更換含有Zeocin的新鮮篩選培養液。
    ⑤對照組正常細胞100%死亡,Zeocin抗性組中存活的細胞即為表達Zeocin抗性基因的細胞。然后根據實驗目的進行多克隆或單克隆細胞的篩選。根據細胞種類和轉染/篩選效率,單克隆細胞株的形成可能需要一周或更多的時間。
    【注】:若待篩選細胞對Zeocin的抗性明顯強于大部分細胞,則按照以下方法克服此類耐受性:用含Zeocin培養液進行細胞接種培養,置于37℃孵育2-3 h,使得細胞貼壁。然后將細胞置于4℃,2 h。需要使用HEPES作為培養基的緩沖體系。重新將細胞置于37℃孵育。4℃孵育細胞的目的是短時間內終止細胞分化,使得Zeocin能發揮作用,殺死細胞。
    (3)穩定細胞株的維持培養
    可采取如下幾種方式之一來維持培養穩定細胞株:
    ①使用含有與上述篩選穩定轉染細胞株相同濃度的Zeocin篩選培養液來維持培養。
    ②降低Zeocin濃度為篩選濃度的一半進行維持培養。
    ③使用剛好能預防敏感細胞生長但不足以致死的Zeocin濃度來維持培養(根據殺滅曲線來判斷)。


    注意事項


    1.本產品僅限于科學實驗研究使用,不得用于臨床診斷、治療等領域。

    2.用于細胞實驗,溶解后,須用一次性針頭濾器過濾除菌。

    3.Zeocin人體有害,操作時請小心,并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內。

    4.Zeocin對光敏感,需避光保存于-20℃。含有該抗生素的平板或培養基也需避光保存。

    5.高離子強度、酸或堿性都會抑制Zeocin的活性,該抗生素在過高或過低pH及弱氧化劑的條件下不穩定,且變性不可逆。在培養細菌時,需適當降低細菌培養基的鹽濃度(低鹽LB培養基,NaCl濃度不能超過5g/L)并調整pH至7.5,從而使其保持活性。

    6.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

    7.抗生素不穩定,請在有效期內盡快使用。
    8.以上數據均來自公開文獻,李記生物暫未本產品進行獨立驗證,僅供參考。


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